aptata . Pseudomonas syringae pv در ایران
چکیده
در بهار و تابستان 81- 1380 نشانه هائی از یک بیماری جدید روی چغندر (Beta vulgaris) در حومه بابل مشاهده گردید.علائم بیماری روی برگ ها به صورت لکه های نکروزه قهوه ای تیره، و اغلب با هاله زرد رنگ در حاشیه بود.در آلودگی های شدیداکثر برگهای بوته خشک شده بودند . از کشت بافتهای آلوده روی محیط آگار غذائی حاوی گلوکز یک سودوموناس لوان مثبت با کلنی سفید تا بژ جدا گردید.جدایه ها در آزمون های کاتالاز، هیدرولیز کازئین،ژلاتین و نشانه و تولید بتا گلوکوزید از مثبت بودند. تمامی جدایه ها از اریتریتول ، فروکتوز ،گلوکز ،گلیسرول ، اینوزیتول ، اینولین ،مانیتول ، مانوز ، سوربیتول ، سوکروز ،زایلو ، لاکتات و D- تارتارات استفاده کرده ، ولی نتوانستند از دولسیتول ، مالتوز ، پالاتینوز، رامنوز یا L – تارتارات به عنوان منبع کربن استفاده کنند. بیماریزائی سه جدایه با تزریق و محلول پاشی سوسپانسیون سلول ها روی بوته های 6-5 برگی چغندر در گلخانه به اثبات رسید. جدایه ها aptata . Pseudomonas syringae pv شناسائی شدند. نقوش الکتروفورزی پروتئین های سلولی جدایه ها شباهت زیادی به نقوش استرین پاتوتیپ aptata . P. syringae pv
مقدمه
بیماری های لکه برگی و بلایت باکتریائی در چغندر (Beta vulgaris) به وسیله چند گونه و پاتوار از باکتری های گیاهی از جمله :
(keyworth et al.) Collins & Jones 1983 Curtobacterium flaccumfaciens pv.betae pseudomonas syringae pv. Syringae Van Hall 1902
Aptata (Brown & Jamieson)yong et al.1978
Aptata (Brown & Jamieson ) yong et al.1978. P. syringae pv
و یک پارتوارXanthomonas که X.campestris pv.betae Robbs etal.1981 نامگذاری شده ، ایجاد می شود(Bradbury 1986 , Whitney & Duffus 1986) . درایران لکه برگی ناشی از Xanthomonas sp. در مزارع چغندر قند در اصفهان وجود دارد، علائم این بیماری که به صورت لکه های رنگ پریده و سپس خشک (نکروزه) و وسیع در پهنک برگ است متمایز از علائم بیماری بلایت باکتریائی ناشی از X.c.pv.Betae گزارش شده از برزیل ، است (samavatian & rahimian 2001) در سالهای 1380-1381 یک بیماری با علائم لکه برگی و سوختگی کامل برگ در برخی از مناطق شهرستان بابل مشاهده گردید . شدت بیماری در بعضی از مزارع به حدی بود که باعث مرگ گیاهچه ها و بوته های چند برگی و سوختگی اکثر برگهای پائینی بوته های مسن تر شده بود. لکه ها اغلب به صورت پراکنده در پهنک برگ و گاهی در حاشیه برگ ها قابل مشاهده بود و آبسوختگی و کلروز مشخصی در اطراف لکه های نکروزه وجو داشت . لکه ها اغلب یک تا چند سانتی متر قطر داشته و به رنگ قهوه ای مایل به سیاه بودند. با گسترش لکه ها به سمت رگبرگ میانی ، بخش وسیعی از پهنک تا تمامی آن سوخته و سوختگی به سمت دمبرگ پیشروی می کرد و نکروز دمبرگ به صورت نوارهای طولی قابل مشاهده بود. علائم بیماری در طول فصل رشد و به خصوص در شرایط هوای خنک و بارانی روی بوته های جوان شدید بود. علائم این بیماری با علائم لکه برگی و بلایت گزارش شده از اصفهان (samavatian & rahimian 2001 ) متفاوت بود. در مشاهده میکروسکپی تراوش جمعیت سلولهای باکتریائی (ooze) از حاشیه لکه های بریده شد.بررسی اخیر در زمینه شناسائی عامل بیماری لکه برگی چغندر در مازندران صورت گرفته است. چکیده نتایج این بررسی قبلاً ارائه شده است (Babaeizad et al.2004) .
روش بررسی
کشت و جداسازی
برگ های چغندر دارای علائم بیماری جمع آوری شد و پس از شستشو با آب، بخش هائی که در برگیرنده یک لکه بود جدا گردید . این قطعات در چند قطره آب مقطر در داخل تشک های استریل به کمک تیغ خرد گردید ند. نیم ساعت پس از نگهداری نمونه ها در دمای آن قطره ای از سوسپانسیون حاصل روی محیط آگار غذائی حاوی %5/0 گلوکز (23 گرم nutrient agar 5 گرم گلوکز در یک لیتر آب ) (NAG) مخطط گردید . تشک های کشت شده در دمای C°25 نگهداری شدند. دو روز پس از کشت ، کلنی های باکتری به رنگ سفید تا بژ برجسته ، به قطر 3-2 میلی متر در سطح ظاهر گردیدند. تک کلنی ها انتخاب و روی محیطNAG تکثیر گردید. جدایه ها روی محیط فوق در یخچال و یا به صورت سوسپانسیون کدر در آب مقطر استریل در دمای اتاق نگهداری شدند. تعدادی از جدایه ها برای نگهداری بلند مدت لیوفی لایز (Lyophilized) (Schaad et al.2001)گردیدند .
آزمون بیوشیمیائی و فیزیولوژیک
آزمون های بیوشیمیایی و فیزیولوژیک طبق روش های متعارف
(schaad et al.2001 ,Lelliott et al.1996,KING et al.1954,Fahy & Persley 1983)
انجام شد بررسی طیف منابع کربن قابل استفاده جدایه ها بر اساس روش های متداول (schaad et al.2001) و با استفاده از محیط معدنی پایه آیر و همکاران (Ayer et al.1919) انجام گرفت . قندها و اسید های آمینه باروش تندال (Tyndall)استریل و غلظت نهائی 1-2/0درصد به محیط پایه حاوی 2/1 درصد آگارز اضافه شد. نمک سدیم اسیدهای آلی جداگانه اتو کلاو شده و به غلظت نهائی 2/0 درصد به محیط آیر اضافه شد (schaad et al.2001) پس از گذشت باکتری ها در سطح محیط های کربوهیدراتی و نگهداری تشک ها در دمایC °28 – 25 ، نتایج استفاده یا عدم استفاده از منابع کربنی براساس مقاسیه میزان رشد و تغییر اسیدیته محیط نسبت به شاهد (محیط آیر فاقد منبع کربنی ) تا سه هفته پس از کشت ارزیابی گردید
(Rahimian 1995 , Lelliott & stead 1987,Fahy & Persley 1983).
انگشت نگاری ژنومی
جداسازی DNA
دو جدایه به عنوان نماینده در انگشت نگاری های ژنومی به کار برده شدند.جدایه ها در محیط آگار غذائی به صورت چمنی کشت شد. پس از دو روز رشد در دمای C °28 – 25 ، سلول ه در آب مقطر به صورت سوسپانسیون در آمدند. پس از سانتریفیوژ کردن سوسپانسیون در g×6000 به مدت 10 دقیقه ، رسوب سلول ها در آب مقطر پخش شده و کدری سوسپانسیون در 1 واحد (optical density)OD در 600 نانومتر تنظیم گردید. OD قسمتی از سوسپانسیون ها در 2/0 – 1/0 واحد تنظیم و به آنها 1/0 حجم KOH یک نرمال اضافه شد.نمونه ها سپس به مدت یک دقیقه جوشانده شدند. از این نمونه ها ،بدون تیمار بعدی و یا پس از سانتریفیوژ به مدت 2 دقیقه در g×9000 و حذف رسوب ، به عنوان DNA الگو (Template) در واکنش های زنجیره ای پلیمراز (PCR) استفاده شد. بخش دیگر سوسپانسیون های تهیه شده برای استخراج DNA به کار برده شد. بافرتریس – EDTA(TE،یک دهم مولار HCI ،Tris،8pH، 10 میلی مولار EDTA ) به حجم مساوی به نمونه ها افزوده شدهSDS به غلظت نهائی 2 درصد ، سلول پاره شدند.DNA به روش های متداول با افزودن فنل و کلروفرم استخراج و با اتانول رسوب داده شد(Ausubel et al.1991).رسوب اسیدهای نوکلئیک در بافر TH × 1/0 حل وپس از تعیین غلظت به کمک اسپکتروفتو متر به بخش هائی تقسیم و در C °20- نگهداری شد. از جدایه های استاندارد P.s.tomato,P.s. aptata(ICMP 459) ( جدا شده از گوجه فرنگی ) ،P.s.syringae (جدا شده از هلو و نیشکر مازندران )،P.s maculicola (ICMP 3935) و P.viridiflava(جدا شده از پرتقال مبتلا به بلاست درمازندران ) نیز DNA استخراج و در انگشت نگاری به کار برده شد.
rep- PCR
rep- PCR (Repetitive exteragenic palindroamic) طبق روش های توصیه شده (( Weingart & Volksch 1997 ,Versal.ovic et al.1991.1994 و با استفاده از پرایمرهای BOXAIR ، ERICIR و ERIC2 انجاک شد. واکنش ها در حجم 50 میکرولیتر و شامل (غلظت نهائی)67 میلی مولار تریس هیدروکلرا ید 8/8 pH ، 5/3 میلی مول کلرید منیزیم ، 10 میلی مول مرکاپتواتانول ، 16 میلی مول سولفات آمونیوم ،400 میکرومول از هر dNTP، 50 میکرومول پرایمر ، 5/1 واحد پلیمراز تک (Taq پلیمراز از سیناژن) ، 8 میکروگرم آلبومین سرم گاوی و 50نانو گرم DNA الگو (و یا 2 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولهای پاره شده با پتاس) و %5 دی متیل سولفوکسید بود. تکثیر با برنامه دمائی 5 دقیقه در C°95 و 33 چرخه 1 دقیقه در C° 94، 1 دقیقه در C°52و 5 دقیقه در C°65 در ترموسایکلر (Personal Cycler,Biometra) انجام شد . طول قطعات با نگهداری نمونه ها در C°72 به مدت 10دقیقه افزایش داده شد. نمونه ها در دمای C°20- تا زمان الکتروفوروز نگهداشته شدند.
الکتروفوز DNA
الکتروفوز قطعات DNA تکثیر شده در ژل %8 پلی اکریل آمید و در بافر تریس – برات EDTA(TBE ، 89 میلی مولار تریس ، 89 میلی مولار اسید بوریک ، 2 میلی مولار EDTA ،2/8 PH ) انجام شد. نمونه ها (10 میکرولیتر پس از اختلاط با 10 میکرولیتر بافر TBE حاوی 1/0 درصد برم فنل بلو و 50 درصد گلیسرول در چاهک های ژل (1/0 × 20 ×20 سانتی متر ) ریخته شده و الکتروفروز در شدت جریان ثابت 20 میلی آمپر تا رسیدن برم فنل بلو به انتهای ژل انجام می گرفت . ژل با نیترات نقره رنگ آمیزی شده (Haas et al.1994) .واز ان عکس گرفته شد.