تعیین برخی ویژگی های فیزیکوشیمیایی و ردیابی سرولوژیکی جدایه ایرانی ویروس کوتولگی زبر ذرت
Partial physicochemical characterization and serological detection of Iranian of maize rough dwarf virus
چکیده
ویروس کوتولگی زبر ذرت (maize rough dwarf virus – Iranian isolate , mrdv-i) یکی از ویروس های مهم در استان فارس محسوب می شود . رابطه این ویروس با ویروس های مشابه در داخل و خارج از ایران هنوز روشن نشده و ردیابی سرولوژیکی آن در سطح وسیع نیز هنوز امکان پذیر نگردیده است . هدف از تحقیق حاضر خالص سازی ویروس ، تهیه آنتی سرم بر علیه آن ، شناسایی میزبان های طبیعی و امکان ردیابی منابع آن در طبیعت و مطالعه برخی ویژگی های فیزیکوشیمیایی آن بود . خالص سازی MRDV-I از طریق سانتریفوژ کردن افتراقی و استفاده از ستون سوکروز دارای شیب چگالی انجام شد . آنتی سرم ویروس با تزریق زیر پوستی آموده خالص سازی شده ویروس به خرگوش تهی و مورد استفاده قرار گرفت . پیکره های MRDV-I در الکترون میکروسکوپ فاقد کپسید خارجی بودند و قطری در حدود 48 نانومتر داشتند. الکتروفورز پروتئین ساختمانی ویروس و متعاقب آن آزمون Westem blot سه پروتئین به اندازه های 113،119،138 دالتون را مشخص کرد . الکتروفورز آر.ان.ای وجود ده قطعه ژنوم را نشان داد هر چند که قطعه دوم ضعیف تر از سایر قطعه ها به نظر می رسید . این ویژگی ژنوم MRDV-I مشابه خصوصیات گزارش شده در منابع برای فیجی ویروس ها و به ویژه جدایه های دیگر MRDV بود . براساس نتایج ELSA گیاهان زراعی گندم و برنج و علف های هرز دژگال ، پنجه مرغی ، ارزن وحشی ، جو موشی ، اویارسلام و ارزن دم روباهی به عنوان میزبانان طبیعی MRDV-I شناخته شدند . تمام گیاهان آلوده گونه های مزبور درجاتی از کوتولگی را در مقایسه با گیاهان ظاهراً سالم نشان می دادند . آلودگی به MRDV-I در جو و علف های هرز دائمی چمن ، قباق و مرغ تشخیص داده نشد . آنتی سرم بدست آمده همچنین قادر به ردیابی MRDV-I در تک زنجره های UNKANODES TANASIJEVICI و LAODELPHOX STRIATELLUS بود . زنجرک های با غلظت بالای ویروس در اوایل بهار در مزارع ذرت ردیابی شدند . با توجه به اطلاعات بدست آمده به نظر می رسد منبع پایداری این ویروس از سالی به سال دیگر زنجرک های ناقل و یا گیاهان دائمی دیگر تیره غلات غیر از گیاهان مطالعه شده در تحقیق حاضر هستند .
واژهای کلیدی : فیجی ویروس ، خالص سازی ویروس ، کوتولگی زبر ذرت ، ذرت ، ناقلین ویروس
مقدمه
بیماری ویروسی کوتولگی زبر ذرت (Maize rough dwarf) اولین بار در سال 1949 در ایتالیا توجه محقیقن را به خود جلب نمود (رجوع شود به conti 1983) .سپس بیماری مشابهی با اسامی مختلف در مزارع ذرت فرانسه ، پرتغال ، اسپانیا ، سوئیس ، سوئد و اسرائیل مشاهده گردید (conti 1983) . در ایران بیماری کوتولگی زبر ذرت برای اولین بار در سال 1360 به عنوان یکی بیماری ویروسی در مزارع مختلف ذرت فارس شناخته شد (Izadpanah et al.1983) . میزان آلودگی در مزارع مختلف ذرت طبق یک برآورده مقدماتی در سال 1360 بین صفر و 35 درصد بود . در سال 1362 میزان آلودگی در برخی در برخی مزارع بع 50 درصد نیز می رسید . در سالهای بعد میزان آلودگی به این ویروس کاهش یافت اما از سال 1382 به این طرف ، مجدداً طغیان وسیع آن مخصوصاً در شمال فارس موجب خسارات سنگین شد ، میزان آلودگی بعضی از مزارع از 80 درصد تجاوز کرد و میزان خسارت ناشی از آن به صد درصد نزدیک شد .
عامل بیماری کوتولگی زبر ذرت در کشورهای اروپایی و اسرائیل ویروسی از جنس Fijvirus ( تیره Reoviridae) به نام (MRDV) Maize rough dwarf virus شناخته شده است . دو ویروس دیگر با علائم و مشخصات مشابه در غلات گزارش شده اند ، یکی به نام mal de rio cuarto virus در ذرت از آرژانتین و دیگری به نام (RBSDV) Rice black – streaked virus در برنج از جنوب شرقی آسیا . هر دو ویروس از لحاظ تاکسونومیکی به MRDV نزدیک هستند (Van regenmortel et al .2000) .RBSDV در چین علاوه بر برنج ، ذرت را نیز آلوده کرده و در آن علائم کوتولگی زیر ایجاد می کند (Azuhata et al . 1993) .
در سالهای اخیر یک بیماری مشابه در مزارع برنج استان مشاهده و عامل آن ویروسی از جنس Fijivirus تشخیص داده شد . این ویروس موقتاً بنام کوتولگی گال سیاه برنج (Rice black gall dwarf virus,RBGDV) نامیده شد (kamran et al.2000) . همزمان با طغیان MRDV در شمال فارس ، RBGDV نیز در مزارع برنج به ویژه در حوزه سد درودزن طغیان نموده و موجب نگرانی کشاورزان شد . تعیین رابطه این دو ویروس می تواند نقش موثری در طراحی روش های کنترل بیماری داشته باشد . هدف از تحقیق حاضر مطالعه برخی جنبه های بیولوژیکی و سرولوژیکی MRDV-I از طریق خالص سازی و تهیه آنتی سرم آن و تعیین برخی ویژگی های فیزیکوشیمیایی این ویروس می باشد . قبلاً گزارشی دربار خالص سازی مخدود این ویروس در ایران منتشر شده است (Behjatnin & izadpanah 1991).
روش بررسی
خالص سازی ویروس
برای خالص سازی MRDV-I از بوته های ذرت با آلودگی طبیعی استفاده شد .بوته های جوان با علائم واضح کوتولگی زیر شامل کوتولگی شدید گیاه توأم با راست ایستادن برگ ها و گال های پشت برگ ( شکل 1 ) از مزارع باجگاه واقع در 15 کیلومتری شمال شیراز جمع آوری و به آزمایشگاه منتقل شدند . سعی شد که بوته ها فاقد علائم ویروس ها و عوامل بیماریزای دیگر ذرت باشند . خالص سازی از بافت ریشه ذرت طبق روش وتر و همکاران (wetter et al.1969) با تغییراتی انجام گرفت . در هر نوبت خالص سازی 200 گرم بافت ریشه پس از شستشوی کامل با آب ، در یک حجم بافر استخراج (0.3 M NA2HPO4 , 0.01 M NA2SO3 , 0.001 M EDTA)همگن سازی شد . به همگنه بدست آمده نیم حجم کلروفوم اضافه و به مدت 10 دقیقه به هم زده شد . پس از سانتریفوژ کردن در سرعت پائین (4500 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه ) ، رونشین جدا و به مدت 90 دقیقه در 27000 دور در دقیقه در گردان شماره 30 بکمن سانتریفوژ شد . رسوب حاصل در 2 میلی لیتر بافر فسفات 02/0 مولار ، 5/7 =PH ، حل و به مدت یک شب در دمای C 4 روی بهم زدن مغناطیسی به هم زده شد .